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展开刚开始能够选择的角色只有一个(Isaac)，随着游戏的推进，会逐渐解锁其他角色。
| 角色名称 | 生命值 | 速度 | 射速 | 伤害 | 射程 | 初始道具 | 备注 | 人物介绍 |
| 以撒 (Isaac) |
3 | 2 | 2 | 2 | 2 | 炸弹x1。 骰子(The Dice) (使用???通关The Womb后才会携带)。 |
默认角色。 基础移动速度100%。 |
亚伯拉罕之子，在游戏开始的剧情中，被要求献祭给上帝。 |
| 抹大拉 (Magdalene) |
4 | 1 | 2 | 2 | 2 | 美味的心(Yum Heart)。 | 在一次游戏中将生命值上限提升到7个心之容器(不计算魂心)解锁。 基础移动速度85%。 |
耶稣在俗世间最亲密的信仰伴侣，也被称作玛丽(Mary)。 |
| 该隐 (Cain) |
2 | 3 | 2 | 3 | 1 | 钥匙x1。 幸运脚(Lucky Foot)。 |
在一次游戏中持有55金钱解锁(不计算已经花掉的)。 基础移动速度100%，左眼被眼罩罩住，只有右眼发射子弹。 |
亚当和夏娃的儿子，亚伯(Abel)的哥哥，后来杀死了亚伯。 |
| 犹大 (Judas) |
1 | 2 | 2 | 4 | 2 | 硬币x3。 恶魔之书(The Book Of Belial)。 |
第一次击败Mom's Heart解锁。 基础移动速度100%。 |
犹大·伊斯卡洛特(Judas Iscariot)，因背叛耶稣而广为人知。 |
| 夏娃 (Eve) |
2 | 3 | 2 | 1 | 2 | 死亡之鸟(Dead Bird)。 巴比伦娼妇 (Whore Of Babylon)。 |
在一次游戏中在恶魔房间里消费两次解锁，即使消费导致角色死亡。 基础移动速度123%。 |
上帝创造的第一位女性。 |
| ??? | -1 | 2 | 2 | 2 | 2 | 魂心x3。 便便(The Poop)。 |
在击败It Lives（END 10）后解锁。 永远无法获得心之容器。通常提升心之容器数量的道具，只会增加一颗魂心；也可直接拾取魂心。 基础移动速度110%。 |
在以撒的空玩具箱（金箱子）内因缺氧逝去的以撒。 |
| 《羔羊的愤怒》资料片新增加的人物 | ||||||||
| 参孙 Samson |
1 | 2 | 2 | 2 | 2 | 魂心x1。 嗜血(Bloody Lust)。 |
解锁方式：击败Mom，并在游戏过程中跳过两间藏宝室。 基础移动速度110%。 子弹飞行速度131%。 |
他因上帝的旨意而降生人间，去击败非利士人(the Philistines)，却因沉迷女色而被剪掉了头发(他的三个力量来源之一，其余两个是禁酒和不近女色)。在失去力量后变为盲人。 |
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责任编辑：Cannon
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